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另外一個不容易解釋的邊緣效應是，在周邊孔中的細胞會集中在孔的外側，如下圖所示（孔內白亮的為細胞集中的區(qū)域）。這種現(xiàn)象在實驗中常用的96孔板中十分明顯。由于大多細胞的生長會受周圍接觸細胞的抑制，所以這種邊緣效應導致邊緣孔內細胞平均生長速度要比其他孔來得慢，從而在實驗過程中引入系統(tǒng)誤差。這種邊緣效應是由于在室溫下的培養(yǎng)板轉移到37℃培養(yǎng)箱后，培養(yǎng)板上產生的溫度差影響細胞沉降引起的。所以這種解決邊緣效應的一個簡單有效的方法，就是在培養(yǎng)板內分入細胞后，在室溫下放置1-2個小時，讓細胞在沒有溫度差的情況下沉降并貼附，然后再轉移到37℃培養(yǎng)箱內[1]。該方法**少適合CHO等在室溫下能貼壁的細胞。 [1]BETINA KERSTIN LUNDHOLT, KURT M. SCUDDER, and LEN PAGLIARO, A Simple Technique for Reducing Edge Effect in Cell-Based Assays. Journal of Biomolecular Screening 2003:566-570 10、細胞培養(yǎng)液簡介 雖然細胞培養(yǎng)的實驗早在19世紀末就開始了，但用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)液主要是動物的血清或淋巴液。被人稱為細胞培養(yǎng)之父的Ross Harrison就是利用青蛙的淋巴液來培養(yǎng)神經細胞的。這樣的培養(yǎng)液不但性質不穩(wěn)定，而且只能進行非常小規(guī)模的細胞培養(yǎng)。 **個人工配制的培養(yǎng)液是由Lewis & Lewis在1911年由海水、血清、胚胎提取物和鹽和蛋白胨為原料配制成的。但是人們對于培養(yǎng)液中的化學成分并不清楚。直到1948年，F(xiàn)isher才研制成了**個化學成分清楚的細胞培養(yǎng)液CMRL1006。 實驗室常用的細胞培養(yǎng)液的主要成分是氨基酸、葡萄糖、無機鹽、維生素和微量元素等。為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)液中一般有一個pH緩沖系統(tǒng)，同時常加入少量的酚紅作為pH指示劑。另外培養(yǎng)液中一般需要加入一定量的血清。 培養(yǎng)液中的氨基酸除了13種細胞生長所必須的氨基酸外，往往加入一些非必需的氨基酸以促進細胞的生長。在必需的氨基酸中，L-谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定（在4℃培養(yǎng)溶液中半衰期為3個星期，37℃中為1個星期），需要在使用時加入。 葡萄糖在培養(yǎng)液中的含量一般為1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）。它是細胞代謝重要的能量來源。 細胞培養(yǎng)液中都有一個平衡鹽系統(tǒng)，用于維持細胞的滲透壓、維持pH和細胞正常的代謝等。**常用的平衡鹽系統(tǒng)有Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS); Earle's balanced salts (EBSS) 和 Hanks' balanced salts (HBSS)。它們都含有細胞所必需的5種離子：鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子和磷酸根。培養(yǎng)液中的pH緩沖系統(tǒng)一般是碳酸氫鈉和HEPES等。 培養(yǎng)液中的維生素包括葉酸、維生素B、煙酰胺和吡哆醇等。培養(yǎng)液中的微量元素元素包括Cu2+ ，Zn2+ ，和Mn2+等。 血清中含有生長因子、促進細胞帖壁的因子、礦物質、激素、脂類等，另外血清可以抑制胰酶的活性。 一般培養(yǎng)液都含酚紅作為pH指示劑，它是細胞培養(yǎng)液狀態(tài)的一個很好的標志。過長時間的培養(yǎng)或者微生物的污染都會使培養(yǎng)液的pH發(fā)生改變。需要注意的是，酚紅可以模擬類固醇激素（尤其是雌性激素）的作用，所以如果培養(yǎng)的細胞對雌性激素敏感（比如實驗本身就是研究雌性激素對細胞的作用），就應當使用沒有酚紅的培養(yǎng)液。 11、選用血清時要注意什么？ 細胞培養(yǎng)使用的一般是胎牛血清。由于胎牛血清價格非常貴，為了節(jié)約，對于一些比較容易生長的細胞，有時候也使用新生牛血清，或者馬血清。 血清中含有血清清蛋白、生長因子等。對于大多數(shù)培養(yǎng)的動物細胞而言，培養(yǎng)液中加入血清是生長必須的。雖然無血清培養(yǎng)液已經出現(xiàn)，但無血清培養(yǎng)液只適用于特定的細胞，而且價格一般比較昂貴，所以在比較長的時間內，細胞培養(yǎng)仍然需要血清。 對于一種特定的細胞，可以從ATCC（American Type Culture Collection）查到培養(yǎng)液中需要加入的血清的種類和濃度。 來自不同商家的血清差異很大，即使來自同一商家的血清，不同批次之間仍然會有非常大的差異。對于培養(yǎng)不易生長的細胞而言，挑選優(yōu)質的血清非常重要。一般來說，可以向血清生產商家索取少量不同批次的血清，經過試驗后找到對細胞生長**有利的批次，然后大量購買該批次的血清，儲存于-80度的冰箱內，供長期使用。 |
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12、細胞培養(yǎng)過程中有哪些污染？ 細胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學污染和生物污染。 化學污染 化學污染是一些對細胞有毒性的或對細胞產生刺激的化學物質。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學試劑和質量較差的蒸餾水等。 化學污染中比較引人注意的是細菌內毒素。它是革蘭氏陰性細菌細胞死亡后解體釋放出的疏水性的細胞壁組成物質，對塑料等疏水性強的物質有很強的吸附能力。細菌內毒素可刺激部分細胞產生一些激素或細胞因子，對細胞生長和實驗結果產生影響。細菌內毒素是臨床上的**主要的熱原（即注射到動物體內會導致動物發(fā)熱），所以通過細胞培養(yǎng)生產的疫苗、細胞因子等用在臨床上的藥品的生產過程中更是要避免細菌內毒素的污染。 生物污染 生物污染包括比較容易發(fā)現(xiàn)的細菌、霉菌和酵母的污染，和較難發(fā)現(xiàn)的病毒、支原體和其他細胞的污染。 細菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環(huán)境中非常快速的生長。這些污染比較容易觀察到，它們往往會使其污染的培養(yǎng)液產生可見的變化，或者通過顯微鏡觀察就可以看見。 由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因為病毒顆粒特別微小，一般的實驗室都沒能力檢查細胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細胞內，對整個細胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會使研究人員長期得到受病毒影響的細胞的實驗結果。 1956 年 Robinson 及其同事**發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初的一個調查發(fā)現(xiàn)，在美G培養(yǎng)的細胞中，**少有15%被支原體污染 。由于支原體沒有細胞壁，在細胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時對常用于細胞培養(yǎng)中的抗生素不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會影響實驗的結果。 培養(yǎng)多種細胞時操作不當，會導致細胞的交叉污染。由于不同細胞的生產速率不同，污染的生長速率快的細胞**終會完全取代被污染的細胞。 13、怎么樣才能減少污染的機會？ 減少化學污染 對于自己用粉末配制培養(yǎng)液的實驗室來說，配制培養(yǎng)液要使用重蒸餾水，以減少帶入化學污染的機會。如果要添加NaHCO3，要選用純度高的NaHCO3，**好是經過細胞培養(yǎng)測試的。 另外盡量使用一次性的細胞培養(yǎng)器皿。由于標準廠家一次性細胞培養(yǎng)器皿的生產環(huán)境比較嚴格，得到的產品潔凈度很高，從而減少了由細胞培養(yǎng)器皿帶入污染的機會。 減少生物污染 由于一般的污染發(fā)生在細胞培養(yǎng)的操作過程中，所以良好的細胞培養(yǎng)操作環(huán)境和操作習慣是減少生物污染的關鍵。 要用一個專門的房間用于細胞培養(yǎng)，注意保持房間的清潔。 要有一個定期檢驗的合格的超凈臺（超凈臺內的潔凈度應該為100級，與計算機硬盤的生產環(huán)境相當）。在使用超凈臺前開啟通風裝置并打開紫外燈滅菌30分鐘。操作時要戴一次性橡膠手套，并噴灑70%酒精消毒。任何帶入超凈臺的非無菌物件都要噴灑70%酒精消毒。收集廢培養(yǎng)液的瓶子要加入漂白粉或漂白液，以避免微生物的生長。每次實驗完后，要向通向廢培養(yǎng)液瓶的塑料管內噴灑70%酒精，并且用蒸餾水和70%酒精先后擦拭臺面（只用70%酒精擦拭會導致灑落在臺面的培養(yǎng)液在臺面上形成難以清除的污垢）。 不要在超凈臺里使用酒精燈等燈具，因為這樣會因燈的熱的火焰引起的空氣對流而破壞超凈臺里本來規(guī)則的空氣層流，使本來存在于超凈臺底層的微粒被帶到上層，帶來更多的污染機會。 加熱培養(yǎng)液的37°C恒溫水浴中非常容易有微生物的生長，從而成為一個重要的污染源。所以需要定期清洗恒溫水浴。 細胞培養(yǎng)箱內的用于保持濕度的水盤也需要定期清洗。 為了減少不同細胞株間的相互污染，不要用同一瓶培養(yǎng)液或胰酶培養(yǎng)不同的細胞；不要在一個超凈臺上同時進行多種細胞的操作。 分裝每次小量使用的溶液（如胰酶、抗生素、谷氨酸溶液），以減少多次使用時污染的機會。以防萬一 即使再小心，污染難免還是會發(fā)生。所以得到一個新的細胞株后的**件事情，是把細胞生長擴增后凍存起來，以備不測。 何況一般的細胞在傳代次數(shù)多了以后，遺傳特性也會發(fā)生改變。通過批量凍存的辦法，可以有效的把培養(yǎng)的細胞控制在一定的代數(shù)以內。 14、內毒素是什么？ 內毒素的化學成分是脂多糖，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組分之一。一個活的細菌很少釋放內毒素，但死后可放出大量內毒素。 內毒素在血液中存在時會引起動物發(fā)熱，是醫(yī)療注射液中**主要的熱原。19 世紀 40 年代開始用注射溶液引起兔的發(fā)熱反應實驗來檢測熱原（主要是細菌內毒素）。 后來研究者發(fā)現(xiàn)鱟（一種海洋生物）血液遇到極微量的內毒素會發(fā)生凝血反應，從而在19 世紀 70 年代**了鱟試劑用于快速精確檢測內毒素。內毒素含量一般用G際單位（ EU ）來衡量，一般來說 1EU 大致等于 0.1-0.2ng。 由于內毒素會對很多種細胞產生刺激，影響實驗結果，所以在實驗中要盡量減少在培養(yǎng)液中的內毒素的來源。 由于生產工藝的提高，來自標準廠家的血清和培養(yǎng)液中的內毒素含量很少。所以現(xiàn)代實驗室細胞培養(yǎng)中內毒素的來源主要是水、添加劑、細胞培養(yǎng)器皿等。傳統(tǒng)的玻璃儀器制備的雙蒸水和通過離子交換柱、活性炭柱和超濾三個環(huán)節(jié)的純水制備儀制備的超純水都能滿足細胞培養(yǎng)用水的要求。盛水器具上的細菌內毒素可能給超純水帶來污染。長時間放置的超純水也可因盛水器具上細菌生長而污染細菌內毒素。 內毒素能緊密的粘在玻璃器皿上，實驗室里用普通的方法不能完全的消除除內毒素。用 250 ℃， 30 分鐘或 180 ℃， 2 小時干熱滅菌能完全除掉玻璃器皿上的內毒素。 一次性塑料器皿經過高溫注塑成型，沒有內毒素存在。但在處理、包裝等生產過程中，可能污染內毒素。杭州生友生物技術有限公司生產的一次性細胞培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等在萬級無塵車間生產和包裝，產品的內毒素含量低于 0.5EU/ml。 15、細胞的凍存 一個實驗室得到一個新的細胞株后，shou先要把該細胞株培養(yǎng)擴增后凍存起來。細胞凍存shou先可以在由于污染等情況丟失細胞時有備份可用，另外幾乎所有細胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異，為了保持實驗結果的一致，一般細胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能再使用了，需要將凍存的，傳代較少的細胞化凍培養(yǎng)再使用。 細胞冷凍過程有四個要點：細胞的收獲、保護劑的使用、冷凍速率和儲存環(huán)境。 細胞的收獲 用來凍存的細胞一般選擇在細胞約鋪滿 90% 的時候，這時細胞生長狀態(tài)好，細胞數(shù)量也多，并且在收獲細胞前 24 小時換一次培養(yǎng)液。收獲用來凍存的細胞開始時方法和平時一樣，用 100xg 離心 5 分鐘收集細胞再重懸，活細胞記數(shù)。稀釋或濃縮到細胞保存的**終細胞濃度的二倍（一般是 400-1000 萬 細胞 /ml ），加入已經配好的等體積的培養(yǎng)液保護劑混合溶液中輕輕混勻，分裝到凍存管，冷凍保存。 保護劑的使用 細胞凍存中， 一般使用DMSO 作為保護劑。在細胞凍存中， DMSO 使用的**終濃度一般是 5-15% ，某種具體細胞的凍存液中的DMSO濃度可以從ATCC查到。對特別敏感的細胞特別是雜交瘤細胞在凍存時使用 95% 血清和 5%DMSO 可能會好些。保護劑在使用時先用培養(yǎng)液或血清配成**終濃度的 2 倍，再與等體積的懸浮細胞的培養(yǎng)液混合。 細胞凍存的速率 細胞的冷凍速率**是控制在讓細胞有足夠的時間脫水而又不被過度脫水導細胞損害。對大多數(shù)細胞來說，每分鐘降 1 ** 3 ℃是合適的。通常的操作是把細胞先在-20℃1-2個小時，再放入 -80℃冰箱過夜（如果沒有-80℃冰箱，可以用干冰替代），再轉入液氮罐或低于 -130℃的冰箱長期保存。 另外一個辦法是，在-20℃1-2個小時以后，把冷凍管懸掉在液氮罐的氣相中，以控制冷卻的速率。這個方法比較簡單，因為細胞也可以在液氮罐的氣態(tài)中長期保留，所以不用計時。對于沒有-80℃冰箱，或者購買干冰不方便的人來說，這是一個比較好的辦法。 儲存環(huán)境 細胞長期保存溫度是 -130 ℃或更低。液氮罐中氣態(tài)層溫度在 -140℃** -180℃之間，細胞可保存在氣態(tài)層或浸入液氮中，如果可能**好保存在氣態(tài)層，因為這樣可避免由于有液氮進入凍存管而在拿出細胞時引起爆炸（但是這樣液氮罐內只能存儲少量液氮，需要經常添加）。細胞也可以在-80℃冰箱保存幾個月左右的時間。 16、怎樣化凍動物細胞？ 化凍過程的原則是要讓凍存的細胞快速融化。 如果細胞儲存在液氮液面下，使用者**好準備好必要的防護器具（**少要戴上護目鏡，**好戴上面罩和較厚的手套），防止進入凍存管的液氮驟然膨脹引起爆炸而造成傷害(筆者曾經在化凍的時候，為了防止污染，把冷凍管放到一個15ml離心管中，而且把蓋子擰上了，打算放到 37℃水浴，恰好回過頭去和別人談話，忽然聽到一聲爆炸聲，回頭一看，15ml的離心管就剩下蓋子了，其他的都爆飛了)。從冰箱或液氮罐取出細胞后將凍存管放 37℃水浴輕輕晃動使之化凍完全，注意不要讓水浸到蓋子以防污染發(fā)生。 由于大多防凍劑與細胞長時間接觸時對細胞有毒害，所以**好盡快除去細胞凍存時加入的防凍劑。 防凍劑的去除方式和細胞的敏感性有關。有些細胞在某些防凍劑存在的條件下能很好的貼壁生長，可以直接將化凍的凍存細胞連同其凍存液加入預備好 15-20ml 培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后換培養(yǎng)液。 對于敏感細胞要加入 10ml 培養(yǎng)液中， 100xg 離心 5 分，去上清后加培養(yǎng)液輕輕重懸細胞，加入培養(yǎng)器皿后在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第二天更換培養(yǎng)液。 |
